zeptometrix 0801010說明書

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Chicken IgY (IgG) ELISA

預(yù)期用途
雞IgY是鳥類中發(fā)現(xiàn)的IgG樣分子的名稱。免疫雞IgY（IgG）
ELISA是一種快速、簡便的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），用于雞IgY的測定。
雞血清、蛋黃或白色、血漿、唾液、粘膜、雞細(xì)胞或其他生物細(xì)胞培養(yǎng)液
樣品。
免疫試驗雞IgY（IgG）酶聯(lián)免疫吸附試驗僅用于研究目的。
試驗原理
用對雞IgY反應(yīng)的多克隆抗體包裹的微孔板孔形成了分析的捕獲階段。正常雞蛋黃抗體
樣品樣品連同提供的標(biāo)準(zhǔn)品用分析稀釋劑適當(dāng)稀釋，然后在
微孔板井。經(jīng)過一個洗滌步驟后，在井內(nèi)捕獲的雞IgY與檢測抗體（一種多克隆抗驚厥藥）一起孵育。
與辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合的IgY。這種抗體只對免疫球蛋白的Fc部分起反應(yīng)。
允許特異性檢測免疫球蛋白的分子。在另一個洗滌步驟之后，顯色底物
加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB），藍色與已添加的雞IgY的量成比例。
與抗體涂層板結(jié)合。通過添加停止溶液來停止酶反應(yīng)，從而產(chǎn)生顏色。
變?yōu)辄S色，可以在450納米分光光度計上測量。然后雞IgY的濃度是
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

試劑
供應(yīng)材料：
微孔板（1 x 96孔）：12 x 8孔條，涂有山羊抗雞IgY
雞IgY檢測抗體（12 ml）：含有HRP結(jié)合山羊抗雞IgY（Fc片段特異性）
雞IgY標(biāo)準(zhǔn)品（7 ml）：在分析稀釋劑中含有125 ng/ml雞IgY。
分析稀釋劑（100 ml）：含有PBS、阻斷蛋白、Triton X-100®
以及2-氯乙酰胺作為防腐劑。
10x洗板緩沖液（125 ml）：含PBS、Tween 20？
和2-氯乙酰胺作為防腐劑
基質(zhì)（12 ml）：含有四甲基聯(lián)苯胺（TMB）
停止溶液（12毫升）：專有配方
微孔板封口機（1 PK）：每包10封
可密封塑料袋（1袋）：用于存放未使用的微孔板條。
Triton X-100是陶氏化學(xué)公司的注冊商標(biāo)。
Tween 20是ICI Americas，Inc.的注冊商標(biāo)。

所需材料但不提供：
個人防護用品（一次性手套、實驗室外套、安全眼鏡等）
蒸餾水或去離子水
汽缸和燒杯
準(zhǔn)備樣品和IGG標(biāo)準(zhǔn)稀釋液的試管和試管架
經(jīng)驗證的可調(diào)節(jié)微量移液管和，單通道和/或多通道
計時器
在18-25攝氏度下驗證的培養(yǎng)箱或溫控室
吸水紙巾
經(jīng)驗證的可在450nm處測量光密度的微型板閱讀器
自動微孔板清洗機或手動真空吸塵設(shè)備
繪圖紙或計算機繪圖軟件
存儲
在2-8°C下儲存所有試劑盒。不要冷凍。未使用過的微孔板條應(yīng)保存在密封袋中，并使用干燥劑
盡量減少受潮。所有儲存和正確處理的試劑至少在打印的有效期之前是穩(wěn)定的。
工具箱標(biāo)簽。
注意事項
在進行分析之前，仔細(xì)閱讀所有說明。
處理套件組件和試樣時，應(yīng)采取通用預(yù)防措施。**
為避免交叉污染，對每個樣品使用單獨的移液管。
當(dāng)測試潛在感染性樣本時，遵守所有適用的地方、州和聯(lián)邦法規(guī)
生物危險品的處置。
停止溶液含有鹽酸，可能導(dǎo)致嚴(yán)重?zé)齻Ｈ绻佑|到眼睛或皮膚，請沖洗
立即用水并尋求醫(yī)療救助。穿防護服和護目鏡。
**MMWR，1988年6月24日，第37卷，第24號，第377-382、387-388頁

試劑的制備
洗板緩沖器：
使用前，在蒸餾水或去離子水中稀釋10倍1:10的洗板緩沖液。*混合。準(zhǔn)備1X洗板緩沖液
可在2-8℃下儲存一周。如有以下情況，可訂購額外的10x洗板緩沖液（ZMC目錄：0801060）
需要。

雞肉標(biāo)準(zhǔn)曲線：
雞IgY標(biāo)準(zhǔn)為125 ng/ml，應(yīng)在分析稀釋劑中稀釋，以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，如
如下表所示。

試樣稀釋：
雞血清或血漿估計有7毫克/毫升的IgY。蛋黃約有6～13mg/ml的IgY。因為
我們建議在試驗稀釋液中制備1:2500～3000倍稀釋液進行初步試驗。為了減少稀釋誤差，
建議采用三個稀釋步驟。例如，三個1:65倍的串聯(lián)稀釋液，其中10μL添加到640μL的分析中。
稀釋劑，是一種方便的稀釋方案。其他樣本可能含有或多或少的IgY，需要稀釋。
適當(dāng)?shù)亍?0倍稀釋液通常足以避免可能的基質(zhì)干擾。
試驗程序
使用前讓所有試劑達到室溫。如上所述制備試劑。將要使用的試管貼上標(biāo)簽
用于制備標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。如果整個微孔板不用于測試，去除多余的
從板架上剝開并用干燥劑放入可密封的塑料袋中。密封袋并在2-8°C下儲存。
步驟1：在其端部凸耳上標(biāo)記每個板條，以確保板條在
化驗。
第2步：用移液管將200μl標(biāo)準(zhǔn)1-6移到重復(fù)的孔中。
第3步：用移液管將每個樣品200μl移到重復(fù)孔中。
第四步：用封板器蓋住微孔板，在室溫（18-25攝氏度）下培養(yǎng)30分鐘。
第5步：抽取每口井的內(nèi)容物，用1X洗板緩沖液清洗4次（見試劑制備）
第節(jié)）。沖洗時，用至少300μl的1X洗板緩沖液填充井內(nèi)，然后抽吸。執(zhí)行4個加注/吸氣循環(huán)。
在后一次清洗循環(huán)后，小心地敲擊吸水紙巾墊，*吸干盤子。繼續(xù)
敲擊直到?jīng)]有觀察到明顯的洗板緩沖液滴。
步驟6：用移液管將100μL雞IgY檢測抗體移到每個孔中。
第7步：用封板器蓋上封板，在室溫（18-25攝氏度）下培養(yǎng)30分鐘。

步驟8：如步驟5所述，用1X版洗滌緩沖液洗滌4次。
步驟9：將吸液管100 L的基片注入每個孔中。
步驟10：在室溫（18-25攝氏度）下培養(yǎng)皿30分鐘，不帶蓋子。藍色會在
水井里裝著雞。
步驟11：用移液管將100μL的停止溶液移到每個孔中。顏色將從藍色變?yōu)辄S色。輕敲微孔板至
混合。
第12步：在15分鐘內(nèi)，用微型板閱讀器讀取450納米處每個孔的光密度。
預(yù)期結(jié)果
下面是一個標(biāo)準(zhǔn)曲線的示例，不應(yīng)用于計算實際樣本。可以觀察到變化
由于移液管、培養(yǎng)箱溫度、讀板器等原因，從實驗室到實驗室。

計算結(jié)果
測試有效性：
?0 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)的平均光密度必須低于0.200。
125 ng/ml的平均光密度必須高于1.000。
當(dāng)平均光學(xué)濃度為
密度值不在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)。
計算：
1。計算每組標(biāo)準(zhǔn)和稀釋樣品的平均光密度（OD）值。
2。使用線性圖紙或繪圖軟件，在Y軸上繪制每個標(biāo)準(zhǔn)的平均OD值與
X軸上相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度。
三。通過這些點繪制適合擬合曲線以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。一個點對點的結(jié)構(gòu)將是
準(zhǔn)確。
4。用標(biāo)準(zhǔn)曲線插值法測定各稀釋樣品的IgY濃度。
5。乘以用于稀釋每個樣品的稀釋系數(shù)，以確定原始樣品的IgY濃度。
樣本。
性能特點
特異性：
免疫電泳和/或酶聯(lián)免疫吸附試驗表明，該試劑盒中的雞IgY檢測抗體僅與Fc反應(yīng)。
雞免疫球蛋白重鏈的一部分，但不含雞免疫球蛋白的Fab部分。對其他非免疫球蛋白無反應(yīng)
檢測血清蛋白。
羊、兔、大鼠、驢、山羊、馬、牛、鼠和人血清均與ELISA反應(yīng)無反應(yīng)。
精度：