Promega ONE-Glo™ Luciferase Assay System （貨號 E6120） 中文說明書

第一部分：產品描述

品牌（Brand）： Promega

英文名（English Name）： ONE-Glo™ Luciferase Assay System

中文名（Chinese Name）： ONE-Glo™ 螢光素酶檢測系統（亦常被稱為ONE-Glo™ 螢光素酶報告基因均相檢測試劑盒）

貨號（Catalog Number）： E6120

規格（Size）： 100ml（系統總容量），包含 100ml ONE-Glo™ Luciferase Assay Buffer 以及 1瓶（vial）凍干態（lyophilized）的 ONE-Glo™ Luciferase Assay Substrate。

預期用途： 本品僅供科學研究使用，不得用于人體診斷、治療或其他臨床程序。本系統專為哺乳動物細胞中螢火蟲（Firefly）螢光素酶報告基因的表達定量而設計，采用均質（Homogeneous）的一步法檢測原理。

第二部分：產品概述與背景

在分子生物學、藥理學和生物醫學研究中，科學家經常需要追蹤特定基因在細胞內的表達情況。為了實現這一目標，研究人員開發出了“報告基因（Reporter Gene）"技術。其中，螢火蟲螢光素酶（Firefly Luciferase，簡稱 Fluc）因其催化反應能夠產生強的生物發光信號，且背景噪音極低，成為了極受歡迎的報告基因工具。

然而，隨著現代藥物篩選和基因組學研究的飛速發展，科研工作者對實驗通量提出了高的要求。傳統的螢光素酶檢測試劑往往存在諸多局限：例如試劑配制后極不穩定、發光信號衰減過快導致無法完成大規模連續讀數、對細胞培養基中的成分（如酚紅、血清、抗氧化劑等）高度敏感導致假陰性，以及在手工或機械臂加樣過程中極易產生泡沫干擾信號等。

正是為了攻克上述技術瓶頸，Promega 公司依托其深厚的酶工程與生物化學底蘊，研發推出了 ONE-Glo™ Luciferase Assay System。該系統采用了一種全新的螢光素酶底物化學配方。它不僅大幅提升了試劑在溶解后的物理和化學穩定性，還顯著降低了傳統試劑有的刺鼻氣味，并且對常見的實驗干擾因素展現出了優異的耐受性。貨號 E6120 作為其 100ml 的中等規模包裝，極其適合中小型實驗室開展 384 孔板乃至 1536 孔板的高通量篩選工作。

第三部分：工作原理詳解

要深刻理解 ONE-Glo™ 系統的強大之處，我們需要從其底層的生物化學反應機制說起。螢火蟲螢光素酶（Luciferase）是一種分子量約為 60 kDa 的單體蛋白，它能夠催化底物發生氧化反應，并將化學能轉化為光能。

1. 經典的兩步發光機制

在經典的螢火蟲螢光素酶反應中，通常需要以下幾種核心底物：D-熒光素（D-Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）、鎂離子（Mg2?）以及氧氣。反應過程主要分為兩步：

• 第一步（腺苷化反應）： 螢光素酶首先催化 D-熒光素與 ATP 結合，生成熒光素-腺苷酸中間體（Luciferyl-adenylate），同時釋放出一分子的焦磷酸（PPi）。

• 第二步（氧化發光反應）： 在氧氣的存在下，該中間體被氧化生成處于激發態的氧化熒光素（Oxyluciferin），當激發態的氧化熒光素回到基態時，便會釋放出一個光子，產生我們肉眼可見的生物發光現象。

2. ONE-Glo™ 系統的化學改良

傳統的商用檢測試劑大多直接使用 D-熒光素作為底物。D-熒光素在水溶液中容易發生自發的非酶促氧化，這導致試劑在溶解后極不穩定，需要現配現用，且伴隨著強烈的硫醇類刺激性氣味。

ONE-Glo™ 系統則采用了一種 Promega 保護的新型螢光素酶底物。這種底物經過特殊的化學修飾，具有以下理化特性：

• 更強的抗自氧化能力： 即使在室溫或含氧環境中，該底物的自發降解速率也遠低于 D-熒光素，從而賦予了試劑長期穩定性。

• 更低的揮發性有機物（VOCs）釋放： 極大地消除了傳統試劑令人不適的氣味，改善了實驗室人員的操作環境。

• 優化的酶動力學曲線： 該底物與螢光素酶的結合效率更高，產生的光子流更強，且“輝光（Glow-type）"持續時間更長（可達 40 分鐘以上），為高通量儀器的連續讀數留足了時間窗口。

當 ONE-Glo™ 試劑加入到含有螢光素酶報告基因的細胞樣品中時，試劑中的去污劑成分會瞬間溫和地裂解細胞膜，將細胞內的螢光素酶釋放到溶液中。隨后，新型底物在酶的催化下迅速發生氧化反應，產生與細胞內螢光素酶表達量呈嚴格正相關的發光信號。科研人員只需使用微孔板讀板機檢測發光強度（Relative Light Units, RLU），即可精準計算出目標基因的相對表達水平。

第四部分：產品核心特點深度解讀

1. 靈活便捷的儲存條件，打破冷鏈束縛

對于常規的生物酶類試劑，嚴格的低溫冷凍往往是維持活性的手段。然而，ONE-Glo™ 系統在配方設計上實現了突破。數據顯示，其溶解后的 ONE-Glo™ 試劑在室溫（約 22°C）下可以穩定存放長達 3 周，而在 2°C 至 10°C 的普通冰箱冷藏環境下更是可以穩定保存 3 個月，期間試劑的功能性僅有約 12% 的自然衰減。這意味著研究人員不再需要頻繁地將試劑在冰盒與冰箱之間來回轉移，極大地簡化了日常實驗的準備流程，同時也為自動化工作站的全天候連續運行掃清了障礙。

2. 尊享清新操作環境，告別刺鼻異味

做過傳統螢光素酶實驗的科研人員一定深有體會，普通 D-熒光素試劑在溶解和反應過程中會釋放出一股濃烈的、類似于臭雞蛋或腐爛蔬菜的揮發性硫化物氣味。這不僅嚴重影響了實驗室的空氣質量，長期吸入還可能對實驗人員的呼吸道造成刺激。ONE-Glo™ 的新型底物從根本上解決了這一痛點，其在整個實驗過程中幾乎不產生任何難聞氣味，為您和團隊提供了一個更加舒適、健康的科研環境。

3. 抗擾能力，無視混合與分裝誤差

在 384 孔板或 1536 孔板的高通量實驗中，機械臂的分液精度和加樣后的混勻力度很難做到孔與孔之間全一致。某些敏感的發光試劑在遭遇劇烈震蕩或形成微小氣泡時，發光信號會出現劇烈波動，導致數據的重現性極差（High CV%）。ONE-Glo™ 試劑展現出了佳的物理耐受性，它對混合和分裝條件的變化極不敏感。無論是在手工操作中稍微搖晃了幾下，還是自動化設備留下了微小的氣泡，其最終的讀數都能保持高度的一致性和穩定性，從而大幅提升了實驗結果的可靠程度。

4. 專為高密度微孔板量身定制

隨著藥物篩選通量的提升，越來越多的實驗室開始普及 384 孔板和 1536 孔板。在這些高密度孔板中，每孔的加樣體積往往被壓縮在幾微升到幾十微升之間，極小的液體體積使得蒸發效應和熱散失變得尤為顯著。ONE-Glo™ 試劑憑借其獨特的緩沖體系和底物配方，即使在如此小體積、高密度環境下，依然能夠提供明亮且持久的發光信號，是開展 siRNA 文庫篩選、CRISPR 全基因組敲除篩選的理想搭檔。

5. 更強的基質效應耐受力，弱化假陰性風險

哺乳動物細胞的生長離不開復雜的培養基，而培養基中往往含有酚紅（pH 指示劑）、血清蛋白、各種氨基酸以及抗氧化劑（如維生素C、谷胱甘肽等）。這些物質中，酚紅和維生素C恰恰是螢光素酶催化反應的天敵，它們會通過淬滅自由基或直接消耗底物的方式來抑制發光信號。ONE-Glo™ 系統經過特殊優化，對這些常見的細胞培養基成分具有高的耐受閾值。研究人員甚至可以在不全移除培養基的情況下直接進行檢測，這不僅節省了洗板的時間，更避免了因清洗不全或細胞脫落所帶來的數據偏差。

第五部分：儲存與運輸條件

為了保證 ONE-Glo™ Luciferase Assay System (E6120) 的最佳性能，請務必嚴格遵守以下儲存與運輸規范：

1. 未開封的原始試劑儲存

• ONE-Glo™ Luciferase Assay Buffer (100ml, 子貨號 E605B)： 收到產品后，應將其存放于 -30°C 至 -10°C 的低溫冰箱中。若短期內（3個月內）頻繁使用，也可將其置于 2°C 至 10°C 的普通冷藏室，其功能性變化極小（約 10%）。

• ONE-Glo™ Luciferase Assay Substrate (1 vial, 子貨號 E606B)： 凍干粉狀態極不穩定，必須在 -30°C 至 -10°C 的環境下避光保存。

2. 運輸條件

本產品在運輸過程中會使用干冰或足量冰袋進行包裝，以確保其始終處于規定的低溫區間內。

3. 試劑復溶后的儲存（重要提示）

當您將 Buffer 加入到 Substrate 凍干粉中，配制成 ONE-Glo™ Reagent（工作液）后，其儲存條件變得非常寬容：

• 室溫（約 22°C）： 可穩定保存 3 周。

• 冷藏（2°C 至 10°C）： 可穩定保存 3 個月。

• 冷凍（-20°C）： 不建議反復凍融。一旦復溶，建議在有效期內一次性用完或分裝保存。

第六部分：實驗所需材料與試劑配制

1. 實驗所需自備材料

• 表達螢火蟲螢光素酶的哺乳動物細胞（貼壁或懸浮均可）。

• 標準細胞培養體系（含血清的培養基，不含干擾性過高的抗氧化補充劑）。

• 可調量程移液器及無菌吸頭（如進行高通量實驗，需配備多通道移液器或自動分液器）。

• 適用于發光檢測的白色不透明微孔板（推薦使用 Corning、Greiner 等品牌的白色底板，以減少孔間信號串擾）。

• 微孔板發光檢測儀（Luminometer），具備單次讀取或動力學讀取模式。

2. ONE-Glo™ 工作液的配制步驟

• 取出一瓶全解凍（或平衡至室溫）的 ONE-Glo™ Luciferase Assay Buffer (100ml)。

• 將 Buffer 全部倒入裝有 ONE-Glo™ Luciferase Assay Substrate (凍干粉) 的玻璃瓶中。

• 蓋緊瓶蓋，用手輕輕上下顛倒混勻，直至瓶底的白色凍干粉全溶解，溶液變為澄清透明狀（此過程通常需要 1 至 2 分鐘）。

• 注意：請勿使用渦旋振蕩器（Vortex）劇烈震蕩，以免產生大量難以消除的泡沫，影響后續加樣精度。

第七部分：標準實驗操作流程 (SOP)

第一步：細胞培養與模型構建

根據您的實驗設計，將穩定轉染或瞬時轉染了螢火蟲螢光素酶報告基因的細胞接種于合適的微孔板中。以 96 孔板為例，每孔接種 1×10? 至 2×10? 個細胞；以 384 孔板為例，每孔接種 5×103 個左右。將細胞置于 37°C、5% CO? 的培養箱中過夜培養，待細胞貼壁并達到約 70% - 80% 的融合度時，進行后續的藥物或基因處理。

第二步：施加實驗干預

根據您的課題需求，向細胞中加入待測化合物（如藥物小分子、siRNA、質粒等）或相應的對照溶劑。繼續培養所需的時間（通常為 6 小時至 48 小時不等，視具體信號響應動力學而定）。

第三步：去除培養基（可選）

如果您使用的是普通的非酚紅培養基，且細胞狀態良好，您可以直接跳過洗板步驟，帶著培養基進行第四步。但如果您的培養基中含有高濃度的干擾物質，或者您追求低背景，可以使用移液器小心吸走舊培養基，并根據需要加入 20µl 至 50µl 的新鮮普通培養基或 PBS。

第四步：加入 ONE-Glo™ 檢測試劑

將配制好的 ONE-Glo™ Reagent 平衡至室溫。按照與孔內原有液體體積 1:1 的比例加入檢測試劑。例如，如果孔內留有 100µl 的培養基，則加入 100µl 的 ONE-Glo™ Reagent。如果是無培養基的干孔，則直接加入 100µl 試劑。

• 小型實驗： 使用多通道移液器快速加入。

• 高通量實驗： 使用自動分液器（如 Multidrop™）設定好流速和體積進行分裝。

第五步：輕晃混勻與孵育

加樣完畢后，使用微孔板振蕩器（Orbital Shaker）以中等轉速（約 300-500 rpm）輕晃微孔板 2 至 5 分鐘，確保裂解液與細胞充分接觸并使酶促反應達到平衡。或者，如果您使用的是可自動振蕩的讀板機，也可以在進艙前手動混勻。

第六步：檢測發光信號

將微孔板放入微孔板發光檢測儀中。設置儀器參數：通常不需要設置激發光濾光片（因為螢光素酶是生物發光，不需要激發），發射光檢測范圍設為全波長或 550nm - 600nm。建議積分時間設置為 0.5 秒至 1 秒每孔。記錄下各個孔位的相對發光單位（RLU）數值。

第八部分：本產品解決的實驗痛點剖析

在過往的科研實踐中，許多實驗室在使用傳統螢光素酶檢測系統時，常常陷入以下困境，而 ONE-Glo™ 正是為解決這些問題而生：

• 痛點一：試劑“見光死"，半衰期太短

 傳統試劑溶解后必須在幾個小時內測完，否則信號驟降。ONE-Glo™ 打破了這一問題，其長達數周的室溫穩定性，讓您可以上午配液，下午甚至第二天再從容讀數。

• 痛點二：氣泡殺手，數據忽高忽低

 在快速加樣時，液體撞擊液面極易產生氣泡。傳統試劑遇到氣泡，光信號會被折射或遮擋，導致同一次實驗的數據變異系數（CV%）居高不下。ONE-Glo™ 對物理擾動具有免疫力，即使帶有微量氣泡，讀數依然堅挺。

• 痛點三：怕水又怕臟，基質干擾大

 很多實驗需要在含有高濃度血清或特定添加劑的培養基中進行。傳統試劑一旦遇到酚紅或抗氧化劑，發光信號會被抑制 50% 甚至更多。ONE-Glo™ 擁有高的“抗污"能力，在復雜的培養體系中依然能保持信號的線性響應。

• 痛點四：氣味熏天，通風櫥里都扛不住

 實驗室的通風系統有時候也扛不住劣質試劑的惡臭。ONE-Glo™ 的環保無味配方，讓您可以安心在超凈臺或普通實驗臺上操作，不必時刻屏住呼吸。

• 痛點五：小體積檢測信號弱，蒸發惹的禍

 在 1536 孔板中，幾微升的試劑眨眼間就會蒸發變干。ONE-Glo™ 的緩沖體系能有效減緩蒸發帶來的影響，保證小體積下的信號強度。

第九部分：常見問題與解決方案 (Troubleshooting)

問題一：發光信號整體偏弱，甚至接近空白背景

• 可能原因： 細胞轉染效率過低；螢光素酶表達量本身極低；檢測試劑配制錯誤（如 Buffer 未全溶解底物）；或者細胞數量過少。

• 解決方案： 優化轉染條件（如更換轉染試劑、調整 DNA 與轉染試劑比例）；增加細胞接種密度；仔細檢查試劑配制步驟，確保凍干粉全化開；延長加樣后的孵育時間至 10 分鐘后再讀數。

問題二：實驗組與對照組之間沒有顯著差異（無響應）

• 可能原因： 藥物或刺激因子劑量不足；作用時間不夠；報告基因載體構建有誤（如啟動子序列缺失）；或者細胞系對該通路不敏感。

• 解決方案： 進行藥物的梯度稀釋測試，尋找最佳起效濃度；延長藥物處理時間；重新測序驗證載體的準確性；嘗試使用陽性對照質粒（如 pGL3-Control）來確認系統是否正常運作。

問題三：數據重現性差，孔間差異極大（CV% > 20%）

• 可能原因： 加樣時產生了大量氣泡且未消除；微孔板震蕩混勻不均勻；細胞在鋪板時分布不均（貼壁細胞聚團）。

• 解決方案： 降低移液器的退吸速度，或使用反向移液法減少氣泡；確保微孔板在振蕩器上放置平穩；在鋪板前使用胰酶充分消化細胞，并用移液槍反復吹打制成真正的單細胞懸液。

問題四：標準曲線線性關系變差

• 可能原因： 螢光素酶濃度過高，發生了底物耗盡（Substrate depletion）；或者檢測試劑過期失效。

• 解決方案： 對高表達的樣本進行梯度稀釋后重測；在檢測高濃度樣本時，適當增加 ONE-Glo™ Reagent 的加入量；檢查試劑的有效期及儲存溫度。

問題五：背景孔（Blank）讀數異常偏高

• 可能原因： 微孔板潔凈度不夠，有還原性物質殘留；發光檢測儀的光路系統受到污染；或者 Buffer 受到熒光素酶的污染。

• 解決方案： 使用全新的無菌微孔板；定期清潔和維護讀板機；確保 ONE-Glo™ 試劑瓶瓶口潔凈，取用后立即封口。

問題六：不同批次試劑之間存在系統誤差

• 可能原因： 不同批次間的底物活性存在微小統計學波動；或者實驗操作人員發生了變動。

• 解決方案： 在進行跨批次的大規模篩選實驗時，務必在各批次中加入相同的質控品（Control），以便在后期數據分析時進行歸一化處理。

問題七：試劑在低溫下出現結晶或沉淀

• 可能原因： ONE-Glo™ Buffer 中含有高濃度的鹽類或緩沖成分，在低溫冷凍下溶解度下降，屬于正常的物理現象。

• 解決方案： 將試劑瓶取出，置于室溫下自然回溫，并輕輕搖晃，待結晶全溶解、溶液變澄清后即可正常使用，不影響性能。

問題八：讀數時出現明顯的雙峰或信號延遲

• 可能原因： 發光檢測儀的參數設置不當（如延遲時間 Delay Time 設置過長或過短）；或者裂解過程不徹。

• 解決方案： 優化儀器參數，通常 Delay Time 設為 0 或 1 秒，Integration Time 設為 0.5 至 1 秒；延長微孔板的搖勻時間，確保細胞充分裂解。

問題九：細胞在加樣后大量漂浮或脫壁

• 可能原因： ONE-Glo™ 試劑中的去污劑濃度對某些極度脆弱的細胞系（如原代神經元細胞、懸浮淋巴細胞）來說略高，導致膜結構瞬間崩解。

• 解決方案： 嘗試用無血清培養基 1:1 稀釋 ONE-Glo™ Reagent 后再加入孔中；或者在加樣前先棄去大部分培養基，保留極少量液體作為緩沖。

問題十：長時間（>2小時）孵育后信號急劇下降

• 可能原因： 雖然 ONE-Glo™ 穩定性佳，但在高溫（>30°C）環境下，或者底物濃度被極度稀釋時，仍可能發生緩慢降解。

• 解決方案： 盡量在室溫（20-25°C）環境下進行操作；如果需要極長的孵育時間，建議分批上機檢測，每次只拿出當前要測的板子。

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（注：本文內容基于品牌公開資料及行業常規信息整理，具體以品牌信息文檔為準。）

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