StemCell 05926 TeSR™-E6多能干細胞培養基應用指南

一、 產品描述

產品基本信息

•   英文全名：TeSR™-E6 （Chemically Defined, Xeno-Free, Serum-Free Medium）

•   中文全名：TeSR™-E6 （成分明確、無血清、無異種成分的多能干細胞培養基）

•   核心品牌：StemCell Technologies（干細胞科技公司，簡稱 SCT）

•   常見貨號參考：05926

•   常見規格參考：500mL

•   核心種屬適用性：經過嚴格驗證，專為人類來源的多能干細胞設計，包括人類胚胎干細胞（hESCs）和人類誘導多能干細胞（hiPSCs）。

•   核心應用領域：作為成分明確的細胞分化基礎培養基，特別適用于需要去除轉化生長因子 β（TGF-β）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的定向分化實驗，同時也是常規無飼養層細胞高通量篩選與維持擴增的優質選擇。

產品外觀與理化特性

TeSR™-E6 基礎培養基在出廠時通常為清澈透明的液體，呈淡紅色或淡橙色（源于添加的 pH 指示劑酚紅，便于肉眼監測培養環境的酸堿度變化）。產品經過 0.1 微米（μm）的精密無菌過濾，并灌裝在醫用級聚對苯二甲酸乙二醇酯（PETG）或聚碳酸酯（PC）無菌瓶中。每一批次產品在放行前均經過嚴格的細胞培養性能測試，確保其能夠支持多能干細胞在連續傳代中保持正常的核型穩定性、高水平的堿性磷酸酶活性以及經典的干細胞克隆形態。

二、 產品核心特點

本產品的設計理念圍繞“精準控制"與“安全性"展開，其核心特點可以深度歸納為以下四個維度：

1.  成分明確（Chemically Defined）

    傳統培養基如同“黑盒"，而 TeSR™-E6 則是一本“打開的書"。本培養基中的所有營養成分、維生素、微量元素、脂質前體以及重組蛋白生長因子均是以精確的濃度添加，沒有任何一種成分是模糊不清的提取物。這種高度的透明性意味著研究人員在使用時擁有絕對的知情權，能夠根據自身的實驗需求精準推算培養基的滲透壓、pH值緩沖能力以及特定信號通路的激活強度，極大地提升了實驗的可控性與數據的可重復性。

2.  絕對無血清（Serum-Free）

    本培養基不含有任何形式的動物或人類血清。血清雖然是傳統細胞培養的促生長利器，但其內部蘊含的數千種未知蛋白質、激素和脂質就如同“盲盒"一樣，不僅會帶來巨大的批次間差異（Lot-to-Lot Variation），還會在后續的轉錄組測序（RNA-seq）或表觀遺傳分析（ATAC-seq）中造成嚴重的背景噪音。采用無血清配方，根絕了這些變量，為單細胞測序等高靈敏度組學分析保駕護航。

3.  無異種成分（Xeno-Free）

    所有組成成分均非來源于動物（Non-Animal Derived），特別是其中添加的生長因子均為通過基因工程在大腸桿菌或酵母表達系統中重組表達并純化而來。這一特性不僅消除了牛海綿狀腦病（BSE）、豬細小病毒（PPV）等動物源性病原體污染的風險，更為未來多能干細胞向臨床治療方向的轉化鋪平了道路，滿足了嚴苛的 GMP（藥品生產質量管理規范）級應用的前置要求。

4.  基于經典配方的精準減法優化

    TeSR™-E6 并非憑空創造，而是建立在干細胞界“金標準"——TeSR™-E8™ 的成熟配方之上。研發團隊通過精準剔除 TGF-β 和 bFGF 這兩種具有強效多能性維持作用的細胞因子，巧妙地打破了細胞的自我更新平衡。這種設計不是為了“維持"，而是為了“引導"，它讓細胞處于一種“隨時待命分化"的臨界狀態，極大地降低了后續啟動分化程序時的阻力，是構建分步式分化方案的理想起點。

三、 儲存條件與試劑準備

為了保證產品中各種不穩定成分（特別是重組蛋白和維生素）的生物活性，正確的儲存與配制操作至關重要。

1. 基礎培養基的儲存

•   短期儲存（頻繁使用期間）：將未開封或已開封的 TeSR™-E6 基礎培養基瓶直接置于 4℃ 冰箱中避光保存。在此條件下，建議在保質期內盡快使用完畢，通常不超過 2-3 周。

•   長期儲存（不頻繁使用）：若短期內不打算使用該培養基，應將其分裝后置于 -20℃ 或 -80℃ 超低溫冰箱中冷凍保存。需要注意的是，反復凍融會導致某些蛋白質變性或沉淀析出，因此強烈建議在分裝時按照每次實驗所需的用量（如 50 mL 或 100 mL）進行分裝，避免整瓶反復凍融。

•   解凍操作：從超低溫冰箱取出的培養基需在 4℃ 環境下緩慢解凍過夜，或在室溫下輕輕搖晃加速解凍。嚴禁使用 37℃ 水浴鍋快速加熱解凍，高溫會瞬間破壞生長因子的空間構象致其失活。

2. 補充劑的添加與儲存

TeSR™-E6 作為一款需要即配即用的精細培養基，通常會配備一支濃縮型的補充劑（Supplement）。

•   儲存條件：補充劑通常在制造后以凍干粉（Lyophilized Powder）形式提供，需置于 -20℃ 密封保存；若已復溶（Reconstituted），則應在 4℃ 短期保存（通常不超過 1-2 周），長期不用需分裝凍存于 -80℃。

•   配制流程：在超凈工作臺內，將解凍至室溫的基礎培養基瓶蓋打開，使用無菌移液管或量筒，根據說明書指定的比例（例如 1:50 或 1:100，具體比例請務必查閱對應批次的產品手冊）量取所需體積的補充劑。將補充劑緩緩滴入基礎培養基中，同時輕柔地晃動瓶子使其充分混勻。切勿劇烈振蕩，以免產生大量氣泡導致蛋白質表面變性。

•   預熱使用：配制完成的培養基在使用前，需提前從 4℃ 取出，置于 37℃ 水浴鍋或恒溫箱中預熱至 37℃。細胞在接觸溫度適宜的培養基時狀態最佳，驟冷或驟熱均會引起細胞應激甚至凋亡。

四、 工作原理：深層次的作用機制解析

要真正駕馭一款細胞培養基，就必須洞悉其在細胞微觀層面觸發的一系列分子級聯反應。多能干細胞的命運抉擇主要由幾條核心的信號通路交織控制，而 TeSR™-E6 正是通過精準調控這些通路來發揮作用。

1. 多能性維持與分化的“陰陽平衡"

在經典的干細胞維持培養基（如 TeSR™-E8™）中，外源添加的 bFGF 和 TGF-β 扮演著“陽"的角色。bFGF 主要通過激活 MAPK/ERK 和 PI3K/AKT 通路來促進細胞的增殖并抑制神經外胚層分化；TGF-β 則通過 SMAD2/3 信號通路抑制視黃酸（RA）介導的中內胚層分化。兩者協同作用，將細胞牢牢鎖定在 pluripotent（多能）狀態。

而 TeSR™-E6 的巧妙之處在于實施了“精準減法"——去除了 bFGF 和 TGF-β。這一操作相當于撤去了壓制細胞分化的“剎車"。在沒有這兩種核心多能性細胞因子的情況下，細胞內部的多能性調控網絡（如 Oct4, Sox2, Nanog 等核心轉錄因子的正反饋環路）由于缺乏外部信號支持而逐漸衰減。細胞開始自發地上調分化相關的基因表達，進入一個極其脆弱但又充滿潛力的“預分化（Primed）"狀態。

2. 細胞外基質（ECM）與整合素（Integrin）的協同作用

干細胞不僅需要化學信號（可溶性因子），還需要物理信號（基質硬度與黏附）。TeSR™-E6 中含有優化的脂質載體和微量元素，這些成分雖然不直接結合細胞，但它們能夠調節細胞膜的流動性和表面受體的折疊。當細胞鋪展在 Matrigel 或 Vitronectin（玻連蛋白）等細胞外基質上時，細胞膜上的整合素受體將外部的物理錨定轉化為內部的化學信號（如 FAK 磷酸化）。TeSR™-E6 提供的營養底物確保了這一機械轉導過程能夠順利進行，從而維持細胞的基礎存活與代謝活性，為接受后續的分化誘導信號做好準備。

3. 無血清環境下的代謝重塑

血清中含有大量的脂肪酸和膽固醇，細胞依賴其進行膜合成。在無血清的 TeSR™-E6 中，這些成分被精確計量的特定脂質前體和抗氧化劑所取代。這迫使細胞的代謝模式從“攫取型"向“合成型"轉變，激活了內質網中的固醇調節元件結合蛋白（SREBPs）通路，這不僅保證了細胞膜在快速增殖中的更新需求，還意外地發現這種特定的代謝壓力能夠進一步促使表觀遺傳重編程，增加分化過程中的基因表達動態范圍。

五、 解決實驗中的哪些核心痛點？

在實際的干細胞研究一線，科研人員常常面臨諸多令人頭疼的棘手問題。TeSR™-E6 的出現，正是為了精準切入并解決這些痛點：

1.  消除分化實驗的“啟動延遲"與“背景噪音"

    在傳統方案中，要將干細胞從維持狀態切換到分化狀態，通常需要一天的時間來清洗舊培養基并讓內源性因子耗盡。這個過程的不可控性強。使用 TeSR™-E6 作為基礎分化培養基，可以直接跳過這個耗時的清洗期，因為其內部原本就不含有抑制分化的 TGF-β 和 bFGF，細胞一接種進去便立刻暴露在分化信號的敏感窗口期，大大縮短了實驗周期，提高了分化效率的均一性。

2.  攻克批次間差異導致的實驗無法重復

    “上個月做成功的分化，這個月又失敗了"，這往往是血清或條件培養基惹的禍。TeSR™-E6 的成分明確特性粉碎了這一問題。無論你在北京的實驗室還是上海的實驗室，無論是今年采購還是明年采購，只要配方比例不變，細胞的響應曲線就一致。這對于需要長期推進的臨床前研究或需要發表在高影響因子期刊上的數據尤為重要。

3.  規避下游基因編輯或組學分析的干擾

    許多研究團隊在進行 CRISPR 敲除或過表達后，需要通過熒光激活細胞分選（FACS）來富集陽性克隆。血清中的多種蛋白質會與抗體發生非特異性結合，導致假陽性或背景過高。TeSR™-E6 的無血清、無異種蛋白特性，為流式分析和單細胞測序提供了一個極度“干凈"的背景，確保了微弱信號也能被靈敏捕獲。

六、 詳細使用方法與標準操作流程 (SOP)

為了充分發揮 TeSR™-E6 的性能，建議嚴格按照以下步驟進行操作。本流程以 6 孔板（約 10 cm2 生長面積）培養 hPSCs 為例。

第一部分：每日維護與換液操作

1.  預熱培養基：從 4℃ 冰箱取出配制好的 TeSR™-E6 培養基，置于 37℃ 水浴鍋中預熱 15-30 分鐘。同時，將含有細胞的培養板從培養箱中取出，放在超凈工作臺的支架上。

2.  觀察細胞狀態：在顯微鏡下快速掃視細胞。健康的 hPSCs 應該呈現高核質比、明顯的克隆邊緣以及光滑的單層鋪展。如果發現克隆邊緣有扁平狀的 differentiating cells（分化細胞，通常形態類似上皮細胞或成纖維細胞），應記錄其位置，以便后續傳代時避開。

3.  更換新鮮培養基：使用無菌移液器，小心吸去孔板內的舊培養基。操作時應將槍頭貼壁緩慢吸取，避免槍頭直接接觸并吹打到底部的細胞層，防止物理損傷。每孔加入 2 mL 新鮮的預熱 TeSR™-E6 培養基。

4.  放回培養箱：將培養板輕輕搖勻，使培養基覆蓋均勻，放回 37℃、5% CO? 及飽和濕度的細胞培養箱中。

第二部分：細胞傳代操作（以 EDTA 溫和消化為例）

當細胞融合度達到 70%-80%（通常在接種后 3-4 天），且克隆中心開始出現重疊或輕微分化時，需要進行傳代。

1.  制備包被板：提前一天或至少提前 1 小時，在新的培養板中加入稀釋好的細胞外基質包被液（如 Matrigel 或 Geltrex），確保底部均勻覆蓋，置于 37℃ 孵育。使用前吸除包被液，用無菌 PBS 輕輕潤洗一次。

2.  消化細胞：吸除舊培養基，用 DPBS（不含鈣鎂離子）輕輕洗滌細胞一次。加入預熱的 0.5 mM EDTA 消化液，淹沒孔底即可。將培養板放回 37℃ 培養箱孵育 3-5 分鐘。

3.  終止消化：在顯微鏡下觀察到克隆邊緣變得松散、細胞間隙增大時，立即取出培養板。加入 2 倍體積的 TeSR™-E6 培養基（含 Rock 抑制劑 Y-27632，濃度 10 μM，以提高單細胞存活率）輕柔吹打終止消化。

4.  細胞重懸與接種：用無菌吸管或移液器將細胞輕輕吹打重懸（避免過度吹打產生氣泡），按 1:6 到 1:10 的比例將細胞懸液轉移至預先準備好的新包被培養板中。補充適量新鮮的 TeSR™-E6 培養基，輕輕十字搖勻，放回培養箱。

第三部分：細胞凍存與復蘇

•   凍存：將處于對數生長期的細胞用 Accutase 或 TrypLE 解離成單細胞，離心收集。用預先冰浴的凍存液（如 CryoStor CS10 或無血清凍存液）重懸細胞至 1-5 × 10? cells/mL。分裝至凍存管，置于程序降溫盒中，-80℃ 過夜后轉入液氮長期保存。

•   復蘇：從液氮中取出凍存管，迅速放入 37℃ 水浴鍋搖晃至剛剛融化（約 90 秒）。在超凈臺內將細胞懸液轉移至含有 5 mL TeSR™-E6 培養基（含 Rock 抑制劑）的離心管中，300 g 離心 5 分鐘。棄上清，用 1 mL 新鮮培養基重懸，接種至預先包被好的 24 孔板中央，補加培養基至總體積 2 mL。

七、 常見問題與深度解決方案 (Troubleshooting)

問題一：細胞復蘇后存活率極低，大面積漂浮死亡

•   深度歸因：無血清培養基對單細胞應激極為敏感。如果在凍存前細胞未達到最佳活力，或者凍存液不適合無血清環境，細胞極易發生凋亡。此外，復蘇時未使用 Rock 抑制劑也是主因之一。

•   解決方案：確保凍存前細胞狀態良好且無分化跡象。復蘇后的前 48 小時內，務必在 TeSR™-E6 中添加 10 μM 的 Y-27632（Rock 抑制劑）以支持細胞貼壁和鋪展。檢查凍存液滲透壓，建議使用專為無血清細胞設計的低 DMSO 凍存液。

問題二：細胞傳代后生長極其緩慢，遲遲不形成克隆

•   深度歸因：這通常是由于傳代比例過低（接種太稀）或細胞外基質（ECM）包被失效導致的。TeSR™-E6 缺乏血清中的粘附促進因子，對底物包被的要求高。

•   解決方案：提高接種密度，初次傳代建議使用 1:3 到 1:5 的比例。重新配制 Matrigel 或 Vitronectin 包被液，確保膠原蛋白濃度達標，且包被時間足夠（至少 1 小時，最好 4℃ 過夜）。

問題三：培養基顏色變黃過快（pH 驟降）

•   深度歸因：細胞密度過高，代謝過于旺盛，產生了大量乳酸；或者培養箱 CO? 濃度失控（偏高）；也可能是由于污染（細菌快速產酸）。

•   解決方案：增加每日換液頻率至每天兩次（早/晚各一次），或擴大傳代比例。檢查培養箱 CO? 探頭是否需要校準。如果懷疑污染，立即丟棄細胞并消毒超凈臺。

問題四：干細胞克隆形態異常（如扁平、邊界不清、出現囊狀結構）

•   深度歸因：這是典型的早期分化跡象。雖然 TeSR™-E6 去除了 bFGF 和 TGF-β，但如果培養環境中有意外的分化誘導因子（如內毒素污染的試劑），或者細胞本身多能性基因表達已下調，就會發生自發分化。

•   解決方案：使用未分化標志物（如 Tra-1-60 或 SSEA-4）進行免疫熒光染色確認。若是輕微分化，可手動刮除分化區域；若大面積分化，建議終止該批次細胞，重新復蘇早期凍存的健康細胞。

問題五：細胞在傳代消化時極易脫落成片，難以解離成單細胞

•   深度歸因：細胞融合度超標（超過 90%），克隆之間互相擠壓堆疊，導致細胞與基質之間的黏附力（通過整合素介導）過強。此外，EDTA 濃度不足或作用時間不夠也會導致鈣依賴性黏附分子（如 E-cadherin）無法有效解離。

•   解決方案：嚴格控制傳代時機，在 70%-80% 融合度時及時傳代。可適當提高 EDTA 濃度至 0.5 mM 或延長室溫下消化時間至 5-7 分鐘，并輔以輕柔的機械吹打輔助解離。

問題六：流式細胞術檢測時發現背景熒光較高

•   深度歸因：盡管 TeSR™-E6 是無血清配方，但其中含有的重組蛋白或細胞在凋亡/壞死時釋放的碎片可能會與熒光標記的抗體發生Fc段非特異性結合。

•   解決方案：在染色前使用 Fc 受體阻斷劑（Fc Receptor Blocking Solution）處理細胞。增加洗滌步驟（DPBS + 2% BSA 洗滌 2-3 次），并確保抗體稀釋液中含有適量的疊氮鈉（NaN?）和 BSA 以降低非特異性結合。

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