Polysciences 23966 線性聚乙烯亞胺（瞬時轉(zhuǎn)染級，分子量 25,000）介紹

基本信息

• 英文全名：Polyethylenimine, Linear, MW 25000, Transfection Grade (PEI 25K™)

• 中文譯名：線性聚乙烯亞胺（瞬時轉(zhuǎn)染級，分子量 25,000）

• 產(chǎn)品貨號：23966

• 品牌：Polysciences

• CAS 登錄號：9002-98-6, 26913-06-4

• 外觀形態(tài)：白色至淡黃色固體

• 分子量：約 25,000 Da

• 分子式：(C?H?N)?

• 熔點：73-75°C

• 溶解性：本品可溶于熱水；在低 pH 值的冷水中亦可良好溶解；此外，還可溶于甲醇和乙醇等極性有機溶劑。本品不溶于苯以及丙酮等非極性或弱極性有機溶劑。

• 儲存條件：室溫（RT）密閉避光保存。

• 主要用途：作為一款可信賴且具成本效益的瞬時轉(zhuǎn)染試劑，廣泛應用于基礎生命科學研究、重組蛋白生產(chǎn)以及基因治療載體的開發(fā)。

這款 PEI 25K 產(chǎn)品經(jīng)過嚴格的理化性質(zhì)表征與生物功能性測試，確保了其在不同批次間的高一致性。它不僅能夠滿足科研人員在 96 孔板等小規(guī)模篩選實驗中的高通量需求，更能夠穩(wěn)健地放大至 100 升乃至更大規(guī)模的不銹鋼生物反應器中進行工業(yè)化蛋白表達或病毒載體生產(chǎn)。每年，全球都有大量的研究機構(gòu)和生物制藥企業(yè)選擇使用 Polysciences/Kyfora Bio 的 PEI 25K，以期在其科研探索或生產(chǎn)工藝中獲得關鍵的競爭優(yōu)勢與成本優(yōu)化。

產(chǎn)品特點

1. 轉(zhuǎn)染效率與表達水平

   本品在 HEK293 及 CHO（中國倉鼠卵巢細胞）等常見的哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中，展現(xiàn)出了極為出色的瞬時轉(zhuǎn)染效率。即使在大規(guī)模生物反應器的復雜流體動力學環(huán)境中，它依然能夠介導外源基因的高效攝取，從而確保目標重組蛋白的高水平表達。

2. 廣泛的工藝 scalability（可放大性）

   從微孔板的高通量篩選，到搖瓶的工藝開發(fā)，再到一次性生物反應器和百升級別的不銹鋼生物反應器，本品的性能表現(xiàn)具有高度的線性可預測性。這種無縫放大的能力極大地縮短了從實驗室發(fā)現(xiàn)到臨床前或商業(yè)化生產(chǎn)的開發(fā)周期。

3. 顯著的成本效益優(yōu)勢

   相較于市面上許多昂貴的商業(yè)化專有轉(zhuǎn)染試劑，研究人員和生產(chǎn)企業(yè)可以使用本品在內(nèi)部自行配制轉(zhuǎn)染復合物。這種做法通常可以將單次轉(zhuǎn)染的總試劑成本降低可觀的比例（在特定工藝優(yōu)化下最高可達 40%），對于需要大規(guī)模質(zhì)粒遞送的基因治療和生物制藥行業(yè)而言，這種成本優(yōu)勢直接轉(zhuǎn)化為巨大的經(jīng)濟效益。

4. 高純度與低細胞毒性

   作為一款專為生物工藝設計的原料，本品具有高的化學純度，并且經(jīng)過嚴格的核酸酶、內(nèi)毒素等污染物檢測。其優(yōu)化的分子量分布和線性結(jié)構(gòu)使其在保證高效基因遞送的同時，將對宿主細胞的毒性降至低，從而維持良好的細胞活率和代謝狀態(tài)。

5. 批次間高度一致，符合法規(guī)要求

   Polysciences/Kyfora Bio 遵循嚴格的質(zhì)量管理體系和生產(chǎn)標準，確保每一瓶出廠的 PEI 25K 都具有高度一致的理化特性和生物活性。這種可靠性對于需要長期穩(wěn)定運行的生物工藝開發(fā)和生產(chǎn)至關重要。

儲存與溶液配制條件

• 原粉儲存：本品以固體粉末或塊狀形式提供，化學性質(zhì)相對穩(wěn)定。建議在室溫（15-25°C）下密閉、避光保存。只要保持干燥并確保容器密封良好，其 shelf life（保質(zhì)期）較長，無需冷藏或冷凍，這也為大規(guī)模倉儲管理提供了便利。

• 工作液配制：

   由于聚乙烯亞胺易吸潮且具有一定的吸濕性，在稱量時需迅速操作。通常建議將本品溶解于無菌的酸性純水（如使用 0.1 N 的 HCl 調(diào)節(jié)超純水或 PBS 的 pH 至 4.0-5.0）中，配制成濃度為 1 mg/mL 甚至更高濃度（如 10 mg/mL）的儲存液。配制過程中可適當加熱（如 37°C 水浴）并劇烈渦旋以促進其全溶解。溶解后的儲存液若短期（數(shù)周）內(nèi)頻繁使用，可室溫存放；若長期保存，建議分裝后置于 4°C 冷藏，防止微生物污染。

• 防污染提示：

   由于本品在偏酸性水溶液中具有良好的溶解性，而在中性或堿性條件下容易析出結(jié)晶或產(chǎn)生沉淀，因此在配制儲存液及稀釋時務必控制好 pH 值。同時，為了避免工作液在操作過程中被細菌或霉菌污染，整個配制過程應在生物安全柜或超凈工作臺中進行，并使用無菌的無內(nèi)毒素離心管和移液器吸頭。

工作原理

聚乙烯亞胺（PEI）作為一種經(jīng)典的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑，其核心工作機制建立在“質(zhì)子海綿效應（Proton Sponge Effect）"以及靜電相互作用的基礎之上。

1. 復合物的自發(fā)組裝

   在酸性至中性的生理環(huán)境（如 pH 7.2-7.4）下，PEI 分子鏈上含有大量的仲胺和叔胺基團，這些基團會發(fā)生質(zhì)子化，使得 PEI 帶有強烈的“正電荷"。而核酸分子（如質(zhì)粒 DNA、siRNA 或用于基因編輯的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)）的磷酸骨架則帶有“負電荷"。當兩者在適當?shù)柠}離子濃度下混合時，正負電荷會通過靜電引力迅速中和，自發(fā)組裝形成納米級別的 PEI/DNA 多元復合物（Polyplexes）。

2. 細胞攝取與內(nèi)吞作用

   這些帶微弱正電荷或不帶電的納米復合物能夠通過與帶負電荷的細胞膜相互作用，被細胞通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用（Clathrin-mediated endocytosis）或非特異性液相內(nèi)吞作用高效攝取進入細胞內(nèi)。

3. 內(nèi)涵體逃逸（Endosomal Escape）

   這是 PEI 發(fā)揮轉(zhuǎn)染作用最核心的機制——質(zhì)子海綿效應。當復合物被包裹在細胞內(nèi)吞形成的早期內(nèi)涵體（Early Endosome）中時，內(nèi)涵體會不斷酸化以降低其內(nèi)部 pH 值。此時，PEI 分子中大量未質(zhì)子化的叔胺基團充當了“質(zhì)子緩沖劑"，吸收內(nèi)涵體內(nèi)多余的氫離子，導致內(nèi)涵體內(nèi)發(fā)生滲透性腫脹并最終破裂。這一過程不僅保護了核酸免受溶酶體的降解，還成功地將核酸釋放到了細胞質(zhì)中。

4. 核定位與基因表達

   釋放到細胞質(zhì)中的質(zhì)粒 DNA 隨后需要進入細胞核才能進行轉(zhuǎn)錄和翻譯。在細胞分裂期，核膜發(fā)生破裂與重建，這為質(zhì)粒 DNA 進入細胞核提供了天然的途徑。一旦進入細胞核，外源基因就會在宿主細胞的轉(zhuǎn)錄機制作用下開始表達，從而產(chǎn)生目標重組蛋白或?qū)崿F(xiàn)基因的沉默與編輯。

解決實驗中的哪些痛點與問題

在生物制藥研發(fā)和前沿生命科學實驗中，研究人員經(jīng)常面臨基因遞送效率低、毒性大、成本高昂以及工藝難以放大等棘手問題。本品正是為了解決這些核心痛點而生的：

1. 破解重組蛋白大規(guī)模表達的“成本困局"

   在利用 HEK293 或 CHO 細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn)重組蛋白、單克隆抗體或疫苗抗原時，傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑成本高，往往令科研人員望而卻步。本品作為一種可自主配制的化學合成聚合物，使得科研機構(gòu)能夠以極低的物料成本實現(xiàn)大規(guī)模的蛋白表達，將寶貴的經(jīng)費集中在下游的純化與表征上。

2. 突破難轉(zhuǎn)染細胞系（如原代細胞、神經(jīng)細胞）的“效率瓶頸"

   某些特殊細胞系（如原代培養(yǎng)的神經(jīng)元、造血干細胞或某些上皮細胞）對外源基因的攝取能力極差。PEI 25K 憑借其獨特的陽離子密度和分子量特征，能夠有效壓縮大片段質(zhì)粒，并通過高效的質(zhì)子海綿效應促進內(nèi)涵體逃逸，從而在這些“頑固化"的細胞中實現(xiàn)可觀的轉(zhuǎn)染效率。

3. 攻克病毒載體包裝（如慢病毒、AAV）的“滴度壁壘"

   在基因治療領域，高滴度病毒載體的制備是決定實驗成敗的關鍵。無論是用于體外細胞改造的慢病毒（Lentivirus），還是用于治療體內(nèi)遞送的腺相關病毒（AAV），其包裝過程都需要將多種質(zhì)粒高效地共轉(zhuǎn)染進包裝細胞系（如 HEK293T）。本品能夠輕松應對多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的復雜需求，顯著提升病毒包裝的產(chǎn)率與滴度。

4. 消除工藝放大過程中的“性能衰減"隱患

   從實驗室規(guī)模的 6 孔板，到 5L 的一次性生物反應器，再到百升級的生產(chǎn)罐，培養(yǎng)體積和流體動力學的改變往往會導致許多轉(zhuǎn)染試劑的性能急劇下降。而本品具有出色的流體力學穩(wěn)定性，其轉(zhuǎn)染效率在從微量滴定板到百升級生物反應器的不同規(guī)模間具有高度的線性相關性，極大地降低了工藝放大的技術門檻和失敗風險。

5. 規(guī)避血清干擾，簡化操作步驟

   許多脂質(zhì)體類轉(zhuǎn)染試劑要求必須在無血清條件下進行轉(zhuǎn)染復合物的孵育，甚至在轉(zhuǎn)染后需要更換培養(yǎng)基，這不僅增加了操作的繁瑣程度，也容易對敏感細胞造成滲透壓沖擊。而 PEI 25K 對血清的存在具有較高的容忍度，在某些情況下甚至可以在含有血清的培養(yǎng)基中直接進行轉(zhuǎn)染操作，大大提升了實驗的通量和便捷性。

使用方法與操作指南

為了獲得最佳的轉(zhuǎn)染效果，建議用戶在正式實驗前建立該產(chǎn)品的標準操作流程（SOP），并進行小規(guī)模的條件摸索（如優(yōu)化 DNA 與 PEI 的質(zhì)量比、細胞接種密度以及復合物孵育時間等）。以下是基于 HEK293 或 CHO 懸浮細胞在搖瓶或生物反應器中進行瞬時轉(zhuǎn)染的典型操作流程框架：

一、 轉(zhuǎn)染前準備

1. 細胞狀態(tài)調(diào)控：確保待轉(zhuǎn)染的細胞處于對數(shù)生長期，且細胞活力（Viability）高于 95%。對于貼壁細胞，應在轉(zhuǎn)染前 24 小時鋪板，使其在轉(zhuǎn)染時達到 70%-90% 的融合度；對于懸浮細胞，應將細胞密度調(diào)整至適宜范圍（通常為 1.0 - 2.0 × 10? cells/mL）。

2. 試劑預熱與平衡：將細胞培養(yǎng)基、無菌 PBS（pH 7.2-7.4）以及配制好的 PEI 25K 工作液（如 1 mg/mL）提前置于 37°C 水浴中預熱平衡。

二、 轉(zhuǎn)染復合物的制備

1. 質(zhì)粒 DNA 的稀釋：根據(jù)轉(zhuǎn)染體系的總體積，計算出所需質(zhì)粒 DNA 的量（例如，每毫升細胞懸液使用 1-2 µg 質(zhì)粒）。將質(zhì)粒 DNA 加入適量（通常為體系體積的 1/10 到 1/20）的預熱 PBS 或基礎培養(yǎng)基（無血清）中，輕輕混勻。

2. PEI 工作液的稀釋與加入：按照預先設定的 DNA:PEI 質(zhì)量比（通常范圍為 1:2 到 1:6，經(jīng)典起始比例為 1:3），取相應體積的 PEI 25K 工作液加入上述稀釋好的 DNA 溶液中。

3. 復合物孵育：將混合液在室溫下輕柔渦旋或上下顛倒混勻，隨后靜置孵育 15 至 30 分鐘。在此期間，PEI 與 DNA 會自組裝形成尺寸均一的納米轉(zhuǎn)染復合物。

三、 轉(zhuǎn)染操作

1. 直接加入體系：將孵化好的 PEI/DNA 復合物直接滴加至細胞培養(yǎng)液中。對于貼壁細胞，建議將復合物均勻滴加到培養(yǎng)基中并輕輕晃動培養(yǎng)板使其分散；對于懸浮細胞，可直接加入搖瓶或生物反應器中，并適度提高攪拌速率以確保均勻分布。

2. 培養(yǎng)與觀察：將細胞放回培養(yǎng)箱（通常為 37°C，5% CO?，適宜濕度）繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后 6 到 24 小時內(nèi)，可根據(jù)細胞狀態(tài)決定是否更換新鮮培養(yǎng)基以去除復合物毒性。

四、 后續(xù)分析與收獲

1. 表達監(jiān)測：在轉(zhuǎn)染后 24、48、72 小時，可通過熒光顯微鏡（若質(zhì)粒攜帶熒光報告基因）、流式細胞術或 ELISA/Western Blot 等手段監(jiān)測目標蛋白的表達水平和細胞活力。

2. 產(chǎn)物收獲：根據(jù)實驗目的，在表達峰值期間收集細胞上清液（用于分泌型蛋白）或裂解細胞（用于胞內(nèi)蛋白），進行后續(xù)的純化或功能驗證。

(注：上述步驟為通用指南，具體參數(shù)需根據(jù)您的特定細胞系、質(zhì)粒特性以及培養(yǎng)體系進行優(yōu)化。)

常見問題與解決方案（Troubleshooting Guide）

在實際的實驗操作中，由于細胞狀態(tài)、質(zhì)粒質(zhì)量、培養(yǎng)環(huán)境等諸多變量的影響，可能會遇到轉(zhuǎn)染效率不佳、細胞死亡等嚴重等問題。以下整理了本品在使用過程中最常見的問題及其背后的科學歸因與解決策略：

問題 1：轉(zhuǎn)染效率極低，幾乎檢測不到目標基因的表達

可能原因分析與對策：

• 質(zhì)粒純度不達標：轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒必須具有高純度（A260/A280 比值在 1.8-2.0 之間）且內(nèi)毒素含量極低（< 0.1 EU/µg）。內(nèi)毒素不僅會嚴重抑制許多細胞系的轉(zhuǎn)染效率，還會引發(fā)細胞毒性。建議改用高純度無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒重新制備 DNA。

• DNA 與 PEI 比例不當：不同的細胞系和質(zhì)粒構(gòu)建體有其最適的電荷比率（N/P ratio）。若比例過低，復合物無法有效形成；若比例過高，則會對細胞造成嚴重毒性。建議以 1:2 為起點，設置 1:3、1:4、1:5 等多個梯度進行比例優(yōu)化。

• 復合物孵育時間不足或過度：孵育時間太短會導致復合物組裝不全，太長則可能導致復合物顆粒過大而被細胞吞噬的效率下降。嚴格控制孵育時間在 15-30 分鐘為宜。

問題 2：轉(zhuǎn)染后細胞大量死亡，細胞活力急劇下降

可能原因分析與對策：

• PEI 殘留毒性：聚乙烯亞胺本身帶有一定細胞毒性，尤其是在大劑量使用時。如果在小規(guī)模實驗中，可以考慮在轉(zhuǎn)染后 18-24 小時更換一次新鮮的預溫培養(yǎng)基，以洗去未被細胞吸收的游離 PEI。

• 細胞密度不適宜：細胞過密會導致接觸抑制，降低內(nèi)吞作用；細胞過稀則在轉(zhuǎn)染應激下容易死亡。務必在轉(zhuǎn)染前確保細胞處于最佳的對數(shù)生長期。

• 培養(yǎng)基成分干擾：雖然 PEI 對血清有較好的耐受性，但某些特定成分（如特定的抗生素或添加劑）可能會與 PEI 發(fā)生不可預知的化學反應。嘗試在轉(zhuǎn)染時使用不含抗生素的培養(yǎng)基。

問題 3：實驗重復性很差，不同批次或孔間差異明顯

可能原因分析與對策：

• 加樣操作誤差：在手工操作時，滴加復合物的部位和混合的均勻程度會極大影響局部細胞的轉(zhuǎn)染效率。建議在使用移液器滴加復合物時，沿著培養(yǎng)液液面緩慢、均勻地打入，并輕輕晃動容器混勻。

• 細胞狀態(tài)不均一：如果細胞在傳代過程中出現(xiàn)了分化或狀態(tài)老化，其轉(zhuǎn)染能力會大打折扣。盡量使用傳代次數(shù)較少（如 < 30 代）且形態(tài)飽滿的年輕細胞。

• PEI 工作液未充分混勻或降解：PEI 儲存液在低溫下可能會變得粘稠甚至析出。使用前務必將其恢復至室溫，并充分渦旋震蕩以確保溶液均一。若發(fā)現(xiàn)儲存液出現(xiàn)渾濁或顏色異常加深，建議棄用并重新配制。

問題 4：在大規(guī)模生物反應器中轉(zhuǎn)染效果遠不如小規(guī)模搖瓶

可能原因分析與對策：

• 混合方式不當：在幾升乃至上百升的反應器中，單純依靠攪拌槳產(chǎn)生的流體剪切力可能不足以瞬間將粘稠的 PEI 和 DNA 混合均勻。建議采用“離線預混合法（Off-line Complexation）"，即在獨立容器中先按比例混合并孵育好轉(zhuǎn)染復合物，然后再通過蠕動泵緩慢、均勻地泵入主反應罐中。

• 通氣與起泡影響：大規(guī)模培養(yǎng)中通常伴隨著強烈的通氣攪拌，過多的泡沫會吸附并破壞轉(zhuǎn)染復合物。可以適當降低攪拌轉(zhuǎn)速，或在培養(yǎng)基中添加適量的消泡劑（需預先驗證消泡劑對轉(zhuǎn)染的影響）。

問題 5：目標蛋白表達量尚可，但伴隨大量細胞碎片和聚集體

可能原因分析與對策：

• 復合物粒徑過大：當 DNA 濃度過高或混合速度過快時，容易形成微米級的粗大沉淀，這些沉淀不僅無法被細胞高效內(nèi)吞，還會引發(fā)細胞的異物反應。優(yōu)化混合手法，采用緩慢滴加并配合輕柔混勻的方式可以有效減小復合物粒徑。

• 細胞凋亡被觸發(fā)：高水平的外源基因表達本身就會給細胞帶來代謝負擔。檢查生物反應器的溶氧（DO）、pH 以及營養(yǎng)物（葡萄糖、谷氨酰胺）濃度，確保在轉(zhuǎn)染期間細胞處于優(yōu)的生存微環(huán)境中。

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