PEI轉(zhuǎn)染的方法

PEI轉(zhuǎn)染的方法

常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（*轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)子和其它調(diào)控元件的分析。一般來(lái)說(shuō)，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來(lái)幫助檢測(cè)。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記，如來(lái)氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。

PEI轉(zhuǎn)染的方法
材料：質(zhì)粒DNA  指數(shù)生長(zhǎng)的真核細(xì)胞    PEI （聚乙烯亞胺，是線性的）  1×HBS （pH7.4）
配方：  PEI 儲(chǔ)存液（100 μM）：稱取125 mg PEI 粉末溶解于50 ml 1×HBS （pH7.4）
中， 0.2 μm 濾膜過(guò)濾，儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆谩?/span>
1×HBS （pH7.4）： 將8.76 g NaCl 溶解于900 ml 超純水，加入20 ml 1 M 的
HEPES，調(diào)pH 值到7.4，定容至1 L，過(guò)濾（0.2 μm 濾膜）后儲(chǔ)存于4℃?zhèn)溆谩?/span>
方法：
1．細(xì)胞分盤(pán)： 通過(guò)胰酶消化收集細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)?培養(yǎng)基以4×105 至8×105
細(xì)胞/cm2 的密度平鋪細(xì)胞于60 mm 組織培養(yǎng)皿上（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇培養(yǎng)皿，
使細(xì)胞貼壁后所占總面積達(dá)到培養(yǎng)皿面積的70-90％）。根據(jù)細(xì)胞貼壁情況于
含5％ CO2 的37℃溫箱中孵育8-24 h,當(dāng)細(xì)胞貼壁*后即可開(kāi)始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染
前換入2 mL 預(yù)熱的無(wú)血清培養(yǎng)基。
2. 制備PEI-DNA 混合物：以60 mm 組織培養(yǎng)皿用420 μL 反應(yīng)總體積為例。準(zhǔn)
備兩支1.5 mL 離心管，一管將質(zhì)粒DNA（總量2-8 μg 為佳）加入240 μL HBS
中，混勻。另一管中則用HBS 將100 μM 的PEI 儲(chǔ)存液稀釋成10 μM，充分
混合。然后取180 μL 10 μM PEI 溶液加入含有DNA 的HBS 中，充分混勻后
室溫靜置20-30 min。zui后將這420 μL 的PEI-DNA 混合液逐滴加入上述單層
細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕搖動(dòng)平皿混勻，置于含5％～7％ CO2 的37℃ 溫箱
孵育。
注：每次用100 μM 的PEI 儲(chǔ)存液前都需要先將其充分混勻，保證所取的
濃度一致。
3. 培養(yǎng)6-10 h 后更換為37℃預(yù)熱的含有血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，16 h 左右
可以觀測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá)。

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